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本方法適用于保健食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中維生素B12(cyanocobalamin)的測(cè)定。
本方法檢出限為4ng。
* 想了解什么是維生素B12 ?
1．方法提要 目前維生素B12的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是微生物法，相對(duì)較繁瑣，而強(qiáng)化在保健食品中的維生素B12含量較微，本法用高效液相色譜儀C18柱對(duì)保健食品中維生素B12在達(dá)到檢測(cè)限的條件下進(jìn)行分離，紫外檢測(cè)，以外標(biāo)法定量。
2．儀器 (1)高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器。
(2)超聲波提取器。
3．試劑 (1)乙腈：色譜純。
(2)超純水：雙蒸水經(jīng)Milli—Q型純水器過(guò)濾。
(3)維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司，含量99％。
準(zhǔn)確稱取維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品16．5mg，置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，為165．0μg／ml標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取1ml，置100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，為1．65μg／ml，再依次對(duì)倍稀釋成0．825μg／ml、0．413μg／ml、0．206μg／ml、0．103μg／ml標(biāo)準(zhǔn)使用液。
4．測(cè)定步驟 (1)膠囊和片劑樣品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)研磨并充分均勻的樣品粉末適量(含維生素B12 5～10μg)，置于20～50ml容量瓶中，加2／3體積的超純水，超聲波提取15min，冷卻后加水至刻度，精濾后于HPLC進(jìn)樣測(cè)定。保健食品中維生素B12 含量一般較低，如采樣量大，可置50ml離心管中，用單標(biāo)定量移液管準(zhǔn)確加入50ml純水，超聲波提取15min，再高速離心10min，精濾后于HPLC進(jìn)樣測(cè)定。
(2)液體樣品：對(duì)顏色較淺的液體樣品，精濾后可直接進(jìn)樣。對(duì)糖漿類或顏色較深的樣品，可取適量(含維生素B12 5～10μg)置于20～50ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精濾后于HPLC進(jìn)樣測(cè)定。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：標(biāo)準(zhǔn)使用液各點(diǎn)分別在高效液相色譜儀中進(jìn)樣測(cè)定，并記錄相應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)色譜條件
色譜柱：Henomenegemini C18，250mm×4．6mm，5μm。
流動(dòng)相：A為水，B為乙腈。梯度洗脫：0～11min：14％B；11～12min：14％～80％B；12～17min：80％B；17～19min：80％．2％B；19～27min：2％B；27～28min：2％～14％B；28～35min：14％B；35min：停止。
檢測(cè)波長(zhǎng)：361nm。
進(jìn)樣量：100μl。流速：1ml／min。
5．結(jié)果計(jì)算 X=(c×V×100)/m
式中X——樣品中維生素B12含量[μg／100g(ml)]；
c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣液中維生素B12的濃度(μg／ml)；
V——樣品液定容體積(ml)；
m——樣品質(zhì)量(g或ml)。
6．注釋 (1)保健食品中維生素B12的強(qiáng)化量較微，高效的色譜柱分離條件及有代表性的采樣和達(dá)到檢測(cè)限的進(jìn)樣量是檢出成功的關(guān)鍵，本方法流動(dòng)相為梯度洗脫，能有效地排除檢樣中其他維生素及礦物質(zhì)和微量元素的干擾，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，適當(dāng)調(diào)節(jié)比例使維生素B12的出峰時(shí)間控制在10min為宜，并同時(shí)做輔料的陰性確證實(shí)驗(yàn)。
(2)本方法線性范圍為0．103～1．650μg／ml，Y=115678x+475．31，r=1。
(3)本方法平均回收率為93．4％，RSD為1．43％(n=9)。
(4)精密度RSD為1．3％(n=9)。
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